En 1906, Tswett definió la cromatografía como: método en el cual los componentes de una mezcla son separados en una columna adsorbente dentro de un sistema fluyente. En la cual los componentes son distribuidos entre dos fases, una de las cuales es estacionaria, mientras que la otra es móvil. La fase estacionaria puede ser un sólido o un líquido, soportado en un sólido o en un gel. Mientras que la móvil es un solvente.
Hoy en día casi no hay campo de la química, biología, medicina, etc. en el que no se utilice la cromatografía en alguna de sus formas, tanto en su vertiente preparativa como en la analítica; por otra parte el desarrollo sobre el uso conjunto de la cromatografía con otras técnicas analíticas, así como el desarrollo de otros tipos de cromatografía, como es por ejemplo la de fluidos supercríticos, hace previsible una extensión aún mayor de su uso.
La cromatografía puede cumplir dos funciones básicas que no se excluyen mutuamente:
> Separar los componentes de la mezcla, para obtenerlos más puros y que puedan ser usados posteriormente (etapa final de muchas síntesis).
> Medir la proporción de los componentes de la mezcla (finalidad analítica). En este caso, las cantidades de material empleadas son pequeñas.
Tipos de Cromatografía.
Las técnicas cromatografías pueden clasificarse en función del mecanismo de
Separación de los componentes entre las fases, o bien por la forma de operar del sistema.
a) Mecanismos de separación
En función del mecanismo de separación, las técnicas de cromatografía pueden clasificarse en:
Cromatografía de adsorción: La separación depende de los equilibrios de adsorción-desorción de los componentes de la mezcla, entre la fase estacionaria sólida y la fase móvil líquida o gaseosa. La fuerza con que es adsorbido un componente depende de la polaridad de este, de la actividad del adsorbente y de la polaridad de la fase móvil. En general cuanto más polar es un compuesto más fácilmente será adsorbido. La cromatografía de adsorción, es una técnica que está particularmente bien adaptada para la separación de compuestos de polaridad baja y media. La separación de compuestos muy polares mediante cromatografía de adsorción requiere, debido a la gran retención que ofrecen, la utilización de adsorbentes muy poco activos, o bien, tratamientos químicos previos para la preparación de la muestra a fin de reducir su polaridad.
Cromatografía de reparto: Está basada en la separación de una mezcla de substancias mediante el reparto existente entre la fase móvil (líquido o gas) y la fase estacionaria (líquida) soportada o ligada sobre un sólido adecuado. La
mayor o menor migración de un compuesto en este tipo de cromatografía, será función del coeficiente de reparto de éste entre la fase estacionaria y la fase móvil:
La cromatografía de reparto es utilizable para la separación de mezclas de compuestos de polaridad media y alta. Ejemplos de este tipo de cromatografía, son las cromatografías sobre papel, sílice hidratada y la cromatografía líquida de alta eficacia en fase reversa.
Cromatografía por tamaño molecular: También llamada de permeación de gel o de tamiz molecular. Consiste en la separación de las moléculas basándose en su tamaño en lugar de en su solubilidad o polaridad. Las fases estacionarias empleadas para este tipo de cromatografía son inorgánicas (zeolitas), o geles orgánicos compatibles con disolventes acuosos (agarosa, poliacrilamida) u orgánicos. Estas fases estacionarias poseen cavidades en las cuales las moléculas de los compuestos a separar pueden penetrar y ser retenidas, siendo las moléculas mayores las eluidas de la columna en primer lugar; el rango de trabajo de estas fases estacionarias, se define como el intervalo de pesos moleculares que pueden ser separados; otro parámetro que caracteriza a este tipo de fases, es su límite de exclusión, que se define como el peso molecular a partir del cual los compuestos pasarán a través del lecho estacionario sin experimentar retención.
Cromatografía de cambio iónico: Las separaciones por intercambio iónico, se llevan a cabo con materiales insolubles y de textura porosa, los cuales presentan grupos reactivos asociados a iones lábiles capaces de intercambiarse con los del medio que les rodea, por lo que inevitablemente este tipo de cromatografía ha de realizarse en medio líquido. La cromatografía de intercambio iónico, es utilizable para la separación de substancias iónicas, tanto inorgánicas como orgánicas.
Cromatografía de papel: es un proceso donde el absorbente lo constituye un papel de Filtro. Una vez corrido el disolvente se retira el papel y se deja secar, se trata con un reactivo químico con el fin de poder revelar las manchas.
Cromatografía de capa fina: se basa en la preparación de una capa uniforme, de un adsorbente mantenido sobre una placa de vidrio u otro soporte.
b) Formas de separación.
Otra posible clasificación de las técnicas cromatográficas, está basada en la forma de operar del sistema cromatográfico. Básicamente existen cuatro formas de operación:
Análisis por desarrollo: Es el método utilizado en los experimentos iniciales de cromatografía. El cromatograma se desarrolla hasta que el frente de disolvente alcanza el final del lecho estacionario, de forma que los constituyentes de la mezcla una vez separados permanecen sobre el lecho al finalizar la separación. La técnica de análisis por desarrollo presenta la ventaja de que es analizable la totalidad de la muestra, incluyendo los compuestos de
muy baja o muy alta retención. Se utiliza fundamentalmente en cromatografía de papel y capa fina.
Análisis por elución: Es la técnica utilizada en casi todas las separaciones cromatográficas analíticas y en muchas preparativas. En ella, el paso de la fase móvil se continúa indefinidamente hasta que los componentes separados de la mezcla emergen al final del lecho cromatográfico. Esta técnica presenta la desventaja de que los compuestos con retenciones muy altas pueden no ser observados.
Análisis frontal: Este método está basado en la diferencia de afinidad del adsorbente por cada una de las sustancias a separar. Se utiliza una pequeña columna, que es saturada sucesivamente por cada una de las substancias a separar, emergiendo de ella el primer componente puro hasta que la columna se satura del segundo componente, momento en el que empezará a emerger éste mezclado con el primero. El análisis frontal tiene su principal aplicación como técnica preparativa para la purificación de substancias.
Análisis por desplazamiento: En este caso, la substancia desplazante va incorporada dentro de la fase móvil. Este método se utiliza tanto para separaciones analíticas como preparativas, siendo muy utilizada en cromatografía de cambio iónico.
La polaridad química o sólo polaridad es una propiedad de las moléculas que representa la desigualdad de las cargas eléctricas en la misma. Esta propiedad se relaciona con otras propiedades químicas y físicas. Al formarse una molécula de forma covalente el par de electrones tiende a desplazarse hacia el átomo que tiene mayor carga nuclear Esto origina una densidad de carga desigual entre los núcleos que forman el enlace. El enlace es más polar cuanto mayor sea la diferencia entre las electronegatividades de los átomos que se enlazan
En resumen la cromatografía es una técnica ampliamente utilizada en la resolución de macromoléculas de interés en la industria biotecnológica, biológica y bioquímica. Esta versión instrumental de la cromatografía convencional resulta ventajosa debido a los pequeñísimos volúmenes que se necesitan para el estudio en cuestión y los resultados se obtienen en un mínimo de tiempo.
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